Gram negatif bakteriler, gram boyama sırasında kristal viyole boyayı tutmayan özellikteki bakterilerdir. Alkolle yıkanan gram pozitif bakterilerde mavi gri renk devam ederken, gram negatif bakterilerde mavi renk kaybolmaktadır. Gram boyamada kristal viyole ardından karşı boya eklenmekte, bu şekilde gram negatif bakteriler kırmızı pembe renge boyanmaktadır. Yapılan bu uygulama gram pozitif ve gram negatif bakterilerin ayrımında oldukça önemlidir. Gram negatif olan bakterilerin çoğu patojendir. Bunların insanlarda hastalık yapma özelliği yüksek olur. Bu gram negatif bakterilerde hücre duvarındaki bazı özelliklerden kaynaklanmaktadır.

Gram negatif bakterilerin hücre duvarı daha ince olur. Hücre duvarının sadece %10 kadarı peptidoglikan maddesinden oluşmaktadır. Dış yüzeylerinde bulunan lipopolisakkarit oldukça yoğundur. Hücre yüzeyi bir kapsülle örtülü olanlarda bu grup bakteridir. Bu lipopolisakkarit maddesinin toksik yapıda olması nedeniyle, daha çok çocuklarda bu bakteriler daha hızlı kana karışmakta ve sepsis rahatsızlığına neden olmaktadır. Bu gruptaki bakterilerin neden olduğu rahatsızlıklarda penisin grubundaki antibiyotiklerde yetersiz kalmaktadır. Bu tür enfeksiyonlarda sefalasporin grubu antibiyotikler daha etkili olmaktadır.